基于线粒体基因组COI和12S rRNA序列的魁蚶中国群体分类学地位研究

东北亚地区不同地理种群魁蚶(Scapharca brouhtonii)的分类学地位仍存在较大争议。为探讨魁蚶中国群体的分类地位,测定了魁蚶中国群体线粒体基因组COI和12S rRNA序列,并从GenBank中下载了蚶科26种贝类的同源序列进行分析。以贻贝科的贻贝(Mytilus edulis)为外群,用邻近法和最大简约法构建了蚶科贝类的分子系统进化树,分析其分子系统进化关系和分类等级。结果显示,魁蚶中国群体的COI和12S rRNA基因的碱基组成、密码子使用率及变异位点等与魁蚶日本群体和粗饰蚶属的Anadara sativa相似,且遗传距离很小,进化树中聚为一支,亲缘关系很近,初步确定魁蚶中国群体的分类地位和魁蚶日本群体一致。本研究结果初步阐明了魁蚶中国群体的分子系统进化地位,有利于掌握魁蚶的遗传背景和资源状况,以应用于自然资源的保护和推动养殖业的发展。     

魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表达分析

通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素(C-type lectin,Sb-Lec1)基因,该基因全长为700 bp,其中,5′-UTR为29 bp,3′-UTR为167 bp,开放阅读框长度为504 bp,编码167个氨基酸,包括长度为23个氨基酸的信号肽序列、129个氨基酸的糖识别结构域(CRD)以及参与二硫键形成的6个半胱氨酸。预测蛋白分子量为19.11 k Da,理论等电点为4.74。多序列比对结果显示,Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与长牡蛎(Crassostrea gigas)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和海湾扇贝(Argopecten irradians)C型凝集素的同源性分别为38%~40%、34%~35%和38%~39%,Sb-Lec1基因编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构,均含有形成二硫键的4个保守半胱氨酸。系统进化分析结果显示,魁蚶先与贝类聚为一支,再与脊椎动物聚在一起,表明魁蚶Sb-Lec1基因在进化树上的位置与其传统分类所处位置一致。采用荧光定量PCR技术,检测了Sb-Lec1基因在组织中的表达情况,发现其在肝胰腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、斧足中均有表达,其中,肝胰腺表达量最高。同时,分析了Sb-Lec1基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的mRNA表达量变化情况。结果显示,与对照组相比,菌刺激组Sb-Lec1基因mRNA在各检测组织中的表达量均显著上调(P0.05),随着刺激时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势。本研究表明,魁蚶Sb-Lec1基因在机体免疫防御方面发挥重要功能。     

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、dNTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化.结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,dNTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L.该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应.使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测.研究表明,实验所建立的OsHV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强.由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料GeneFinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景.     

魁蚶苗种的潜沙行为观察

根据魁蚶苗种的壳长将其分为6组：0．50cm组、1．00cm组、1．50cm组、2．00cm组、2．50cm组、3．00cm组,在实验室条件下,对不同规格魁蚶Scapharcabroughtonii苗种的潜沙行为及潜沙能力进行了观察。结果表明：魁蚶潜沙行为分为准备期、潜沙期及结束期,其中潜沙期主要包括伸出斧足、竖壳、潜沙3个主要动作;不同规格的魁蚶苗种,其潜沙能力差异明显。壳长为0．50cm的组,潜沙准备时间（8．5min）、潜沙时间最长（24min）,潜沙率最低（10％）;壳长为1．50—3．00cm时,魁蚶的潜沙准备时间和潜沙时间明显缩短,潜沙率提升至90％以上;壳长为1．50cm组的魁蚶完成潜沙的时间最短,在10min之内能够完成潜沙过程。     

Cd~(2+)、Cu~(2+)及石油烃对毛蚶谷胱甘肽S-转移酶活性的影响

采用浓度梯度污染暴露室内模拟方法,研究了不同浓度的石油烃和Cd2+、Cu2+对毛蚶谷胱甘肽S-转移酶活性的影响。不同质量浓度的Cd2+处理毛蚶16d,谷胱甘肽S-转移酶与对照组无显著变化;而Cu2+处理组,谷胱甘肽S-转移酶活性受到显著的抑制;石油烃处理组,明显地诱导毛蚶谷胱甘肽S-转移酶活性。结果表明,毛蚶体内谷胱甘肽S-转移酶对重金属Cd2+的变化不敏感;毛蚶体内谷胱甘肽S-转移酶活性受到重金属Cu2+抑制,但其最大抑制率低于50%;石油烃诱导毛蚶体内谷胱甘肽S-转移酶活性,最大诱导率高于50%,其谷胱甘肽S-转移酶活性的变化与石油烃的质量浓度显著相关。毛蚶体内谷胱甘肽S-转移酶活性可作为生物标志物用来评价水生态系统中石油烃的污染程度。     

魁蚶血细胞分类及其免疫功能的初步分析

借助显微观察和鳗弧菌免疫刺激等手段,首次对魁蚶血细胞进行分类及免疫功能分析.魁蚶血细胞可分为3大类:红细胞、白细胞和血栓细胞,红细胞发育过程大致经历新生、成熟、衰老和死亡4个阶段.白细胞分为:嗜酸性、嗜中性、嗜碱性细胞,以及淋巴细胞和巨核细胞.嗜酸性、嗜中性、嗜碱性细胞和血栓细胞均参与血液的凝固;红细胞、白细胞均有吞噬病原菌能力,红细胞具有被动吞噬作用和免疫吸附作用,白细胞具有主动吞噬作用,嗜酸性和嗜中性细胞是吞噬病原菌的主体,嗜碱性细胞具有吞噬大颗粒异物的作用,魁蚶感染病原菌后白细胞增多并表现炎症.研究表明,魁蚶血细胞在应对外界的免疫刺激时,能作出系统免疫应答,且血细胞免疫分工明确,以抵御外界不良刺激.     

软体动物毛蚶RNA干扰技术的应用研究

为了在软体动物中建立RNA干扰技术,以用于毛蚶基因功能研究。通过体外转录技术合成双链RNA,并将其注射毛蚶干扰目标基因的表达。肌肉注射双链RNA 48 h后取样,用RT-PCR技术检测目标基因的表达变化,以确定干扰的有效性。结果显示：各目标基因的表达均能被各自特异的双链RNA有效干扰而降低。在注射双链RNA后不同时间点,即12、48、72、96、120 h,取样检测目标基因的时序表达,以确定目标基因表达被干扰的时间效应。发现目标基因的表达在48 h即能有效降低,而且有效时间能持续至120 h以上。对注射双链RNA的动物个体,于48 h取样检测不同组织的目标基因表达,发现毛蚶的RNA干扰效应能系统性地在不同组织发生,表明干扰效应能在不同组织之间进行传递。因此,本研究报道了一种稳定的毛蚶RNA干扰技术,为在毛蚶中进行基因功能鉴定和抗病毒研究提供了一个有效的分子生物学的方法。     

毛蚶保活技术研究

[目的]探讨毛蚶的无水保活技术。[方法]以毛蚶为研究对象,设置不同温度组（-1.3～25℃）的贮藏条件,并使用海水浸透的纱布控制100%的湿度对各温度组进行湿度控制,同时进行充氧包装,研究温度、湿度和氧气对毛蚶成活率的影响。[结果]毛蚶的结冰点为-1.6℃左右,生态冰温区域在-1.6～0℃。随着温度的升高,毛蚶成活率逐渐降低。成活率最高的为冰温保藏（-1.3～0℃）,在第6天时存活率仍为100%。控制湿度组成活率总体优于不控制湿度组,充氧包装可以提高毛蚶的成活率。[结论]温度是毛蚶保活的基本条件,在一定温度范围内,温度和毛蚶成活率呈负相关性;控制湿度和氧气供应对毛蚶的保活效果具有正面影响。     

底质粒径和水温对不同规格毛蚶苗潜沙能力的影响

为探究底质粒径和水温对毛蚶Scapharca subcrenata苗潜沙能力的影响,以小、中、大3种规格的毛蚶(壳长分别为5~8、9~12、13~15 mm)为试验对象,并以细、中、粗3种沙(粒径分别为125~250、251~500、501~1000μm)为底质,进行了不同底质粒径对不同规格毛蚶苗潜沙率影响的研究,同时进行了水温(5、9、13、17、21、25℃)对不同规格毛蚶潜沙率影响的研究。结果表明:试验初期(10min),小、中、大3种规格的毛蚶在粗粒径底质中的潜沙率总体低于细、中粒径底质条件下的潜沙率,并分别在300、60、120 min时达到细粒径底质条件下的潜沙率;480 min前,小规格组毛蚶的潜沙率总体高于同期中、大规格组,480 min后,大规格组毛蚶的潜沙率总体高于同期中、小规格组;试验结束(1440min)时,底质粒径对毛蚶潜沙率的影响均不显著(P0.05),相对小规格个体,大规格毛蚶潜沙率更高;当水温为21℃及以下时,毛蚶潜沙率随着温度的升高而升高;水温为25℃时,试验初期(40 min)毛蚶的潜沙率较高,但之后潜沙率上升缓慢且出现个体死亡现象。研究表明:壳长为5~12 mm的毛蚶在粒径为251~500μm的底质条件下潜沙率较高,而壳长为13~15 mm的毛蚶在粒径为125~250μm的底质条件下潜沙率较高;水温21℃时,壳长为9~12 mm的毛蚶潜沙率最高。     

魁蚶过氧化氢酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(Sb CAT)基因c DNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。Sb CAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,Sb CAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,Sb CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测了Sb CAT的组织表达特征。结果显示,Sb CAT m RNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,Sb CAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。